Grazie all’inserimento della figura del biologo a tempo pieno presso il Centro di ricerca dell’Azienda Ospedaliera di Padova è stata eseguita l’estrazione del DNA di tutti i pazienti attualmente in carico all’ambulatorio per le malattie neuromuscolari. Sono state effettuate analisi molecolari relative ai geni che risultano maggiormente candidati ad essere mutati in base alle caratteristiche cliniche dei pazienti e dei dati di letteratura. In particolare sono stati analizzati i seguenti geni:
Malattie neuromuscolari: MYH7, GAA, SGCA, SGCB, SGCG, SGCD, CASQ1, FKRP, LAMA2, MICU1, CPT2, POMT1, POMT2, POMNGT1, LARGE, FKTN, GNE, DES, MYOT, CRYAB, ZASP, FLNC, BAG3
Malattie del motoneurone: AR, SOD1, FUS, TARDBP, C9ORF72, TUBA4A, PFN1
Si fa presente infine che molti dei test molecolari eseguiti si sono collocati all’interno di percorsi che hanno permesso di definire il corretto inquadramento diagnostico di pazienti con malattie neuromuscolari e quindi l’inserimento nel Registro Malattie Rare.
Si sono avviate collaborazioni informali con altre Neurologie (Mestre, Portogruaro e Verona) che inviano presso il nostro laboratorio campioni di loro pazienti affetti da SLA con richieste per test genetici a fini di diagnostica e di ricerca.
Si è messo a punto un test di conferma della mutazione nel gene C9orf72 come suggerito dalle più recenti linee guida. La tecnica (Southern Blot) è stata acquisita dalla Dott.ssa Bertolin presso il laboratorio del Prof. Vincenzo Silani all’Istituto Auxologico di Cusano Milanino. Ad oggi l’analisi di questo gene nei pazienti SLA seguiti presso l’ambulatorio di Padovainclude questo test di conferma.
Sono stati condotti screening per valutare la frequenza di mutazione in 2 nuovi geni (TUBA4A e TREM) implicati nella patogenesi della SLA. Questa ricerca nella coorte di pazienti raccolta dal nostro centro ha avuto un importante significato in termini scientifici in quanto ha permesso di confermare l’importanza del contributo di questi difetti genetici nella nostra realtà territoriale e di stabilirne la frequenza di mutazione. Lo studio ha voluto indagare nello specifico la frequenza di mutazione di questo nuovo gene nella realtà veneta. Pertanto, sono stati scelti come soggetti su cui svolgere l’analisi, un considerevole numero di pazienti della coorte raccolta negli anni dall’ambulatorio del Motoneurone di Padova.
E’ stato avviato uno studio specifico avente l’obiettivo di identificare marcatori genetici che influenzano il decorso della SLA, con particolare attenzione al ruolo del muscolo scheletrico nella genesi della malattia. Tale studio si sviluppa fondamentalmente su due fronti:
- identificare biomarcatori di malattia specifici per la SLA che consentano di monitorare in maniera chiara e definitiva la progressione di malattia. Ad oggi non esistono biomarcatori specifici per la SLA e l’identificazione di queste molecole si rivelerebbe di fondamentale importanza per dare indicazioni sulla prognosi dei pazienti e come strumenti per valutare l’efficacia di nuovi farmaci. Ad oggi è in corso uno studio che valuta i livelli della proteina NOGO-A, sia a livello proteico che di MRNA mediante esperimenti di Western Blot e Real-Time PCR, nelle biopsie muscolari di pazienti affetti da SLA.
- Identificare fattori genetici che modulano il decorso di malattia nei pazienti affetti da SLA. Per ottenere tale risultato, sta per iniziare uno studio che mediante analisi di polimorfismi di singolo nucleotide (SNP) distribuiti lungo tutto il genoma si propone di valutare le differenze genetiche tra uno specifico sottotipo di SLA con decorso particolarmente favorevole e pazienti affetti da SLA classica.
E’ stata avviata una collaborazione con un gruppo di ricerca afferente all’University College of London (coordinato dal dott. Pietro Fratta). Nel dettaglio, il progetto si propone di studiare molecolarmente l’effetto patogenetico che mutazioni del gene FUS causano a livello delle cellule dei pazienti.
In collaborazione con l’istituto Auxologico di Milano (Prof. Silani e Dott. Ticozzi) si sono effettuate delle analisi di sequenziamento su tutto il genoma (DNA) con un approccio di nuova generazione di pazienti affetti da SLA familiare al fine di identificare nuovi geni malattia. Nello specifico mediante lo studio delle variazioni identificate sulle sequenze che codificano per tutti i geni noti (esoma) si spera di identificare nuove mutazioni causative di SLA nei soggetti indagati. L’identificazione di nuovi geni consente di definire meglio i processi cellulari alterati nella malattia e quindi definire meglio i meccanismi patogenetici coinvolti.
La referente del progetto per la parte biologica, è stata contattata dal Dott. Petrucci di Roma per collaborare ad un loro progetto di ricerca sui pazienti SLA. Nel dettaglio il contributo che ci è stato richiesto riguarda lo screening di circa 40 pazienti raccolti dal Dott. Petrucci per i 4 geni più frequentemente mutati nella SLA (C9ORF72, SOD1, TDP, FUS).
Le attività di ricerca descritte, si sono concretizzate nella pubblicazione di numerosi articoli scientifici negli anni 2014-2015 che hanno come coautori i professionisti del team del “Centro Clinico specializzato per la diagnosi, l’assistenza e la ricerca per le malattie neuromuscolari”. Di seguito vengono riportati quelli che riteniamo maggiormente significativi:
- Semplicini C, et al. Clinical and genetic spectrum in limb-girdle muscular dystrophytype 2E. 2015 Apr 28;84(17):1772-81.
- Querin G, et. The blurred scenario of motor neuron disorders linked to Spatacsinmutations: a case report. Eur J Neurol. 2014 Oct;21(10):e85-6.
- Pennuto M, et al. 210thENMC International Workshop: Research and clinical management of patients withspinal and bulbar muscular atrophy, 27-29 March, 2015, Naarden, The Netherlands. Neuromuscul Disord. 2015 Jun 19. pii: S0960-8966(15)00657-4.
- Pensato V, Tiloca C, Corrado L, Bertolin C, Sardone V, Del Bo R, Calini D,Mandrioli J, et al.TUBA4A gene analysis in sporadic amyotrophic lateral sclerosis:identification of novel mutations. J Neurol. 2015 May;262(5):1376-8.
- Kleinbub JR, et al. Hypnosis-based psychodynamic treatment in ALS: a longitudinal study on patientsand their caregivers. Front Psychol. 2015 Jun 16;6:822.
- Mazzini L, et al Human neural stem cell transplantation in ALS: initial results from a phase I trial. J Transl Med. 2015 Jan 27;13:17.
- Cirulli ET, et al. Exome sequencing in amyotrophic lateral sclerosisidentifies risk genes and pathways. Science. 2015 Mar 27;347(6229):1436-41.
- Smith BN, et al. Exome-wide rarevariant analysis identifies TUBA4A mutations associated with familial ALS.Neuron. 2014 Oct 22;84(2):324-31.
- Palmieri A, et al. Female gender doubles executive dysfunction risk in ALS: a case-control study in 165 patients. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2015May;86(5):574-9.
- Bertolin C, et al. Improving theknowledge of amyotrophic lateral sclerosis genetics: novel SOD1 and FUS variants.Neurobiol Aging. 2014 May;35(5):1212.e7-1212.e10.
- Fogh I, et al. A genome-wideassociation meta-analysis identifies a novel locus at 17q11.2 associated withsporadic amyotrophic lateral sclerosis. Hum Mol Genet. 2014 Apr 15;23(8):2220-31.
